Imagerie à feuille de lumière

Depuis 2010 la plateforme à mis en oeuvre deux solutions d'imagerie complémentaires, sur le site de l'IPMC et sur le site du laboratoire Biodev qui utilisent un éclairage de l'échantillon par un pinceau lumineux.

Ultramacroscope

Ce système est un prototype original, disponible sur la plateforme pour imager vos échantillons et peut être dupliqué sur demande. Il a été développé en collaboration avec le Service de Mécanique Mutualisé (S2M) de l'Observatoire de la côte d'azur avec le soutien du GIS Ibisa et initié dans le contexte d'Actions Nationales de formation CNRS du Réseau Technologique de Microscopie de Fluorescence Multi-dimensionnelle.

 

Principe et finalité

Les coupes histologiques fines ne permettent pas de transmettre une information spatiale globale sauf au prix de reconstructions et recalages laborieux d'images. L’« Optical Coherence Tomoraphy » et l’« Optical Projection Tomography » (Sharpe et al., 2002) Ultramacroscopeont été spécifiquement développées pour de grands échantillons (1mm à 1 cm) pour obtenir des reconstitutions tridimensionnelles d’objets à partir de leurs projections selon différent angles. La résolution de ces techniques est de l’ordre de quelques microns. La microscopie confocale et bi-photons sont limitées  en profondeur (300 à 700µm), et la résolution axiale de ces microscopies (z) est inférieure à la résolution latérale. Au début des années 1990, le développement du microscope confocal thêta (Linde et Stelzer, 1994). a fourni un nouvel outil pour l'étude des échantillons avec une résolution 3D élevée et isotrope. Le principe fondamental est la détection de la lumière de fluorescence à un angle de 90 degrés par rapport à l'axe d'éclairage. Par ce biais une nouvelle approche du sectionnement optique a été envisagée en illuminant  le spécimen avec une feuille de lumière dans un plan perpendiculaire à la détection. L'équipement d'éclairage à feuille de lumière développé sur la plateforme est basé sur le principe de l'ultramicroscope (Dodt, et al., 2007). Il permet d'imager en 3 dimensions des échantillons biologiques transparents ou clarifiés sans nécessité d'effectuer des coupes sériées. Il a été pensé pour être modulaire et ouvert sur les dispositifs de détection disponibles dans le commerce.

Caractéristiques

  • Le système peut imager des objets de tailles comprises entre 1-3 millimètres jusqu'à 1-3 centimètres.
  • Il possède un double éclairage de l'échantillon pour obtenir des images homogènes d'échantillons transparents de grande taille.
  • Il peut se positionner sous tous les macroscopes commerciaux (MVX10 Olympus, AF100 Nikon, Leica Z16 APO, Axio Zoom.V16 Carl Zeiss)

Détails techniques du système disponible

  • Source de lumière : banc laser (Oxxius LBX-4C) avec 2 sorties fibrées monomode commutables 0/100% d'intensité. 4 lasers (P>40mW en sortie de fibre) : 405, 488, 561, 640 nm
  • Optique de mise en forme des faisceaux : doublet achromatique suivi d'un diaphragme puis d'une lentille cylindrique de focale 10 cm : résolution axiale du système à 488nm = 5µm
  • Porte échantillon : l'échantillon est translaté verticalement et perpendiculairement aux faisceaux qui le traversent dans une cuvette spécialement conçue.

L'optique et le porte échantillon sont solidarisés sur le banc qui constitue le module.

  • Détection :

    Cerveauyz

    Cerveau

    • Macroscope MVX10 Olympus équipé avec des objectifs Plan Apochromatiques 1X/0,25 et 2X/0,5 : plages de grandissement de 0,63X à 12,5X
    • Roue de filtres 4 positions (Bleu 447/60, Vert 520/35, Rouge 612/69, Rouge lointain 679/41)
    • Caméra sCMOS (Orca Flash4 Hamamatsu)
  • Pilotage du système avec le logiciel µManager

    Cerveauxz

Applications

  • Imagerie 3D en fluorescence/autofluorescence :
    • Organismes transparents (racines, plancton, poisson zèbre...)
    • Organes ou tissus clarifiés à l'aide du protocole 3Disco, iDisco, Carity, SeeDB...

Ci-contre : images des coupes optiques obtenues sur cet instrument à partir d'un cerveau de souris clarifié contenant un glioblastome RFP : coupes XZ, XY, YZ. Images de coupes orthogonales d'après  Enriched environment reduces glioma growth through immune and non-immune mechanisms in mice. Garofalo S, D'Alessandro G, Chece G, Brau F, Maggi L, Rosa A, Porzia A, Mainiero F, Esposito V, Lauro C, Benigni G, Bernardini G, Santoni A, Limatola C. Nat Commun. 2015 Mar 30;6:6623. Vidéos rubrique "Supplementary"

  • Imagerie 3D en réflexion

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OpenSPIM

Ce système est un prototype élaboré à partir du système "open source" openSPIM en collaboration avec le Service de Mécanique Mutualisé (S2M) de l'Observatoire de la côte d'azur avec le soutien du GIS Ibisa. Il disponible sur la plateforme pour imager vos échantillons.

Principe et finalité

La technique de "Single Plane Imaging Microscopy" (SPIM) utilise le principe de détection de la lumière de fluorescence à un angle de 90 degrés par rapport à l'axe d'éclairage. L'illumination  du spécimen avec une feuille de lumière dans un plan perpendiculaire à la détection permet d'effectuer un sectionnement optique et l'imagerie des échantillons à haute résolution sur des périodes de temps prolongées. il a été utilisé de façon spectaculaire pour enregistrer le développement d'embryons d'organismes modèles tels que la drosophile et le poisson zèbre avec une résolution cellulaire pendant le développement de l'échantillon. L'obtention d'images 3D en cinétique de spécimens vivants de taille supérieure à 300µm sous différents angles est actuellement difficile à réaliser avec les autres techniques de microscopie (à partir du site openSPIM).

 

Caractéristiques et détails techniques

  • Le système peut imager des objets de tailles comprises entre 300 µm à 800 µm environopen_spim
  • C'est un système monolithique sur banc optique qui comporte une diode laser 488nm (Coherent, Cube 488 50mW), à terme le système aura un second laser (Oxxius, 561 nm, 50mW) pour les sondes fluorescentes émettant dans le rouge.
  • Optique de mise en forme des faisceaux : lentille cylindrique de focale 5 cm puis objectif 10X/0.3W : résolution axiale du système à 488nm ~2µCuve_spimm

 

  • Détection au travers d'un objectif 10X/0.3 W, caméra sCMOS (Orca Flash4 Hamamatsu)
  • Pilotage du système avec le logiciel µManager
  • Porte échantillon : l'échantillon est disposé verticalement dans un capillaire de téflon ou dans un tube d’agarose. Il est translaté verticalement, horizontalement et en focus (z)  devant l’objectif de détection. La feuille de lumière reste immobile. Il peut être aussi mis en rotation (roulette de la souris).SPIM_dualcam
  • Le positionnement de l’échantillon dans ce type de système est souvent une phase de réglage assez délicate. Ainsi nous avons implémenté un nouveau dispositif d’aide au centrage avec 2 caméras de type webcam positionnées de part et d’autre de la cuve où se trouve l’échantillon. Le centrage de l’échantillon se fait en « live » via la souris et sous µManager. (présenté à LSFM Bordeaux 2016 Jérôme Mutterer & Christian Rouvière)

Applications

  • Imagerie 3D en fluorescence/autofluorescence d’organismes transparents
  • Imagerie 3D en réflexion